Elle est née à Fitzroy, en Australie, dans la banlieue de Melbourne, en 1842, de parents écossais.

Melbourne était une ville neuve, puisqu’elle fut fondée en 1835.

Sa famille est devenue pauvre et Mary a pris comme emploi un poste d'institutrice à l'âge de 16 ans.

Elle a rencontré le Père Julian Tenison Woods qui voulait fonder une congrégation religieuse.

Il a voulu que ses membres vivent dans la pauvreté et se consacrent à l'instruction des enfants pauvres.

Mary est devenue le premier membre et la supérieure de cette congrégation des Sœurs de St Joseph du Sacré-Cœur, (appelées aussi Joséphites) fondée en 1866.

Elle a alors ouvert la première école de la congrégation dans une écurie hors d'usage de Penola, en Australie-Méridionale. La Congrégation s'est agrandie rapidement et s'est étendue à Adelaïde et à d'autres régions de la colonie.

En 1870, les Joséphites ont eu vent d'allégations selon lesquelles le père Keating, de la paroisse Kapunda, au nord d'Adélaïde, avait abusé sexuellement des enfants. Les Josephites dénoncèrent ce prêtre et il fut renvoyé en Irlande dans le déshonneur, sous prétexte d'abus d'alcool.

Un collègue de ce prêtre accusé, qui avait de l'influence auprès de l'évêque âgé et malade, a attaqué la réputation des sœurs laissant circuler la rumeur de détournement de fonds. Mary a été excommuniée en septembre 1871 pour insubordination par Mgr Sheil.

La communauté des Joséphites ne fut pas dissoute mais la plupart de ses écoles furent fermées à la suite de cette action.

Puisqu'on avait interdit à Mary tout contact avec des membres de l'Église, celle-ci vécut temporairement avec une famille juive, ainsi que chez des prêtres jésuites

Les fidèles se mirent à déserter l'Église et l'épiscopat australien dut se saisir de l'affaire. Sur son lit de mort Mgr Sheil demanda que soit levée l'excommunication qui pesait sur Mary MacKillop, ce qui fut fait le 21 février 1872.

On considéra les accusations non fondées, particulièrement celles ayant trait à l'administration de la Congrégation. Plus tard, une commission épiscopale l'a totalement disculpée.

Les autres investigations ont confirmé que son excommunication était contraire au droit canonique. Elle est une des seules catholiques excommuniées à avoir été canonisée.

En 1873, Mary alla à Rome et gagna l'approbation du pape qui permit aux Joséphites de garder leur autonomie.

MacKillop travailla avec force dans toute l’Australie et en Nouvelle-Zélande, se déplaçant à cheval de Penola à Adélaïde, en passant par l’arrière-pays pour finalement s’installer à Sydney. Elle créa des écoles, des couvents et des établissements charitables comme des orphelinats, des refuges pour sans-abris, pour indigents, pour anciens prisonniers et prostituées, en Australie et en Nouvelle-Zélande.

Elle était fragile de santé et, en 1901, elle fut victime d'une hémorragie cérébrale. Bien qu'elle soit restée mentalement alerte, elle perdit sa mobilité et mourut en 1909.

Depuis sa mort, les sœurs de Saint-Joseph continuent de vivre selon sa devise : « Ne jamais voir un besoin sans chercher à y répondre ».

En 1973, la cause de béatification de Mary Mackillop a été introduite. En 1995 elle devenu la première Australienne à être béatifiée.

Sa canonisation a eu lieu le 17 octobre 2010. Cela fait d'elle aussi la première sainte australienne canonisée.